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免疫鸡卵黄抗体研究进展

来源:     发布日期:2017-6-8 18:45:42   |    分享    加入收藏   关注:


        免疫鸡卵黄抗体研究进展

  卵黄抗体(IgY)指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来,卵黄抗体的研究不断深入,目前在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究得比较清楚,并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就免疫鸡卵黄抗体的研究进展作一综述。

  1、卵黄抗体的形成

  禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后,法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞,分泌特异性抗体进入血液循环,当血液流经卵巢时,特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积,形成卵黄抗体;当卵细胞分泌进入输卵管时,流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中,形成卵清抗体。IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果,因而IgG可在卵细胞中大量蓄积,浓度高于血液中的IgG。与卵黄抗体相比,卵细胞在输卵管中移行的时间较短,因而卵清抗体含量极微。卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液,为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护,在雏鸡疾病预防中具有重要作用,但同时也会干扰鸡疫苗的免疫效果。

  2、IgY的性质

  IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa,由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成,分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。

  IgY与一般哺乳动物IgG相比,IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。

  在低于75℃条件下,IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降,65℃时可保持24h以上,70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃,30min条件下巴氏消毒不影响IgY;高于80℃,大部分IgY失去活性。

  IgY在pH4.0-11.0时比较稳定,pH3.0-3.5时活性迅速下降,pH12时活性亦有所下降。

  IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力,但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后,几乎所有活性丧失,但在pH4.0时1h后可保持91%的活性,甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h,活性分别保持39%和41%。

  3、IgY的作用机理

  特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上,改变病原细胞的完整性,直接抑制病原菌的生长;卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上,使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞;一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下,降解为可结合片段,这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分,这些小肽很容易被肠道吸收,进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合,使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性,而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。

  4、IgY分离、提纯方法

  卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪,其比例为1:2。大部分蛋白质都是脂蛋白,存在于卵黄颗粒中,不溶于水,只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类,从水溶性蛋白中分离IgY。

  多年来,已建立了许多较为高效而经济的方法,这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶,如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

  1980年,Polson首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法,分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀,用硫酸铵盐析法去除PEG。1985年,在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法,使产量提高,而且能有效地去除残留PEG。1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法),PEG法和DS法的产量相当,但提取的IgY制品含有一定量的杂蛋白。Bade和Stegemann(1984)用预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质,经DEAE柱层析进一步纯化,其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别,且稳定性好,经3次以上冻融,抗体活性未见改变。1992年Akita等用水稀释法(WD)提纯IgY,每个卵黄可获得100mg以上的IgY。此后,Akita等比较了WD法、PEG法、DS法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果,结果表明:WD法产量最高,其次为DS法,WD法更适合大规模生产。

  1993年,Horikoshi提出了冷乙醇分级离心的方法,分别用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀离心,得到纯度达99%以上的IgY。此法适用于大规模制备IgY。

  工业上大规模生产IgY的方法有:超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。

  5、IgY在动物疾病防治方面的应用

  5.1 IgY在动物疾病预防方面的应用

  研究表明,IgY能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY,以使其获得有效的被动免疫。何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体,对2-3日龄雏鹅进行预防,其保护率高达100%。杨晓梅等用鸭病毒性肝炎I型鸡胚毒免疫鸡,制备的鸡抗鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体,经实际应用于预防时,雏鸭的平均成活率为96.9%。

  5.2 IgY在动物疾病治疗方面的应用

  目前,卵黄抗体己被广泛应用于许多疾病的防治。汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎(DHV)的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时,当用1万倍LD50强毒时保护率可达到100%。张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群,治愈率为95.2%。此外,应用多种病原菌免疫制备的卵黄抗体还可以防治多种病原菌的感染。詹丽娥等用IBD、ND和EDS-76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病,总有效率可达50%以上。日本成功地从鸡蛋中提取出能够杀死幽门螺旋杆菌的抗体,并以这种抗体为原料制成了能杀死人体内幽门螺旋杆菌的酸奶。

  用卵黄抗体治疗疾病,安全、高效且无公害,我国已有商品化的卵黄抗体供应。

  5.3 1gY在动物疾病诊断方面的应用

  卵黄抗体和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处,如它不与金色葡萄球菌A蛋白结合,不与哺乳动物Fc受体结合,对哺乳动物补体无固定作用等,这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度,所以卵黄抗体可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等。郑厚旌等用卵黄琼扩实验检验卵黄中的IBD抗体水平,结果表明用卵黄琼扩试验替代血清琼扩试验检测IBD抗体水平是可行的,并且具有经济、省力、省时的特点。此外卵黄抗体有望取代传统的多克隆抗体的生产,获取大量更有效的抗体,同时也可减少对动物的副反应,提高动物的福利。

  6、IgY开发前景

  IgY作为替代抗生素的新型饲料添加剂正在引起人们的关注,IgY取代抗生素用作生长促进剂,不会产生药物残留,是一种安全的绿色添加剂。

  生产技术较为成熟:用鸡卵黄大量生产、制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。

  IgY产量高,价格低廉。

  使用IgY技术生产免疫球蛋白,可以减少对动物的应激,提高动物的福利。

  年龄较大的动物会导致IgY分解失活,然而通过包埋处理可避免这一问题。Shimizu等(1993)用脂质体包埋IgY,在pH2.8的胃蛋白酶中37℃温育1h,包埋的IgY仍可保存80%的活性。

  综上所述,鸡卵黄免疫球蛋白是一种高产、优质的多克隆抗体,而且鸡大规模工业化饲养成本低,经济方便,同时制备IgY的工艺相对简单。因此,IgY在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。应用卵黄抗体防治疾病也有不可避免的缺点,如可能带有蛋传染性疾病的病原,对养禽业存在潜在的威胁。

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